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“Caracterización molecular de las bacterias patógenos oportunistas asociados a infecciones pulmonares en niños con Fibrosis Quística en el Perú.

publicado a la‎(s)‎ 13 ago. 2016 12:26 por Sol Samaniego
Agradecemos al Programa de Maestría en Biotecnología Molecular de la Universidad Nacional de Tumbes y especialmente a Benoit Diringer y Ruth Aquino por el importante trabajo en beneficio del mejor tratamiento para los pacientes fibroquísticos Peruanos. Invitamos a los interesados en leer este importante artículo.
"Molecular characterization of opportunistic pathogens bacterias associated to lung infections in children with Cystic Fibrosis in Peru.
Yrene Urbina1, Ruth Aquino 2 Emely Gonzales2, Ingrid Meza2, Virna Cedeño1,2, Juan Rivera4, Sol Samaniego5, Cesar Rodríguez1, Darwin Quevedo1, Benoit Diringer3.
1. Universidad Nacional de Tumbes, Tumbes-Perú.
2. Programa de Maestría en Biotecnología Molecular, Escuela de Posgrado, Universidad Nacional de Tumbes, Tumbes, Perú.
3. Investigación y Capacitación en Biotecnología - Inca'Biotec S.A.C, Tumbes, Perú.
4. Instituto Nacional de Salud del Niño - INSN.
5. Asociación de Padres de Niños con Fibrosis Quística - FIQUI - PERÚ, Lima, Perú.

RESUMEN
En los pacientes con Fibrosis Quística (FQ), la morbilidad y la mortalidad se asocian principalmente a infecciones microbianas crónicas de las vías respiratorias inferiores. En el presente trabajo las comunidades bacterianas cultivables procedentes de muestras de esputo de 21 pacientes pediátricos fueron identificadas a nivel molecular. Las bacterias fueron aisladas mediante técnicas microbiológicas estándares, mientras que la caracterización de las cepas puras se realizó por secuenciación del gen ARNr 16S y análisis por espectrometría de masas MALDI TOF y MALDI TOF TOF. Se lograron aislar e caracterizar molecularmente 127 cepas, identificando 25 especies mientras algunas cepas pudieron ser identificadas solamente hasta el nivel de género. Los patógenos predominantes fueron Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus. El análisis por MALDI TOF permitió obtener espectros representativos de cada especie aislada, lográndose también recuperar y caracterizar por MALDI TOF TOF secuencias peptídicas de las especies más comunes. Los resultados obtenidos servirán para la construcción de una base de datos de cepas patógenas nativas mientras que la identificación de péptidos por MALDI TOF TOF abre el camino para establecer la relación entre el proteoma bacteriano y su patogenicidad. 
Palabras clave: Bacterias, ARNr 16S, Maldi TOF TOF, Perú.

ABSTRACT
In patients affected by Cystic Fibrosis (CF), morbidity and mortality are mainly associated with chronic microbial infections of the lower respiratory tract caused by opportunistic pathogens. In this study the cultivable bacterial communities were characterized from sputum samples from 21 Peruvian paediatric patients with CF. Bacteria were grown and isolated by standard microbiological culture techniques, while the characterization of inbred strains was performed by sequencing the 16S rRNA gene and analysis by MALDI TOF and MALDI TOF TOF mass spectrometry. It was possible to isolate 127 strains which were differentiated into 25 species whereas some strains could be identified only to the genus level. The predominant pathogens were Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. MALDI TOF analysis allowed us to get a mass spectra representative of each isolated species, whereas the application of MALDI TOF TOF permitted to recover and characterise peptides sequences of the most common species. With the results obtained by 16S rRNA and MALDI TOF analysis, we obtained specific spectra of bacteria of Peruvian patients which will serve to build a database of native pathogenic strains for future studies while protein identification by MALDI TOF TOF paved the way to establish the relationship between bacterial proteome and its pathogenicity. 
Keywords: Bacterias, 16S rRNA, MALDI TOF TOF, Peru

INTRODUCCIÓN
La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva, potencialmente mortal, que afecta alrededor de 70.000 personas en todo el mundo (Paganin et al. 2015). Es causada por mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la FQ (CFTR). Las mutaciones en el CFTR reducen el volumen de líquido de la superficie de las vías respiratorias, disminuyendo de este modo el aclaramiento mucociliar de los patógenos bacterianos, lo que causa inflamaciones crónicas (Chmiel y Davis 2003).
La microbiología de las bacterias de las vías respiratorias en pacientes con FQ,  durante muchas décadas ha sido determinado por métodos de cultivo centrándose en los organismos más frecuentemente aislados, como Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Haemophilus influenzae (Hauser et al. 2011). Sin embargo, con la evolución de los métodos de diagnóstico, otros organismos oportunistas emergentes están siendo reportados como asociados a la degradación de la función pulmonar en pacientes con FQ (Bittar & Rolain, 2010).

Es por ello la importancia de la identificación temprana de los patógenos oportunistas pues es vital para evitar la instalación y la proliferación microbiana en las vías aéreas que conllevan a la muerte. Por ello, el uso de las biotecnologías moleculares ha contribuido fuertemente a mejorar el diagnóstico clínico a través de la caracterización molecular de los microorganismos. En la actualidad, el análisis de la secuencia del gen 16S ARNr se ha impuesto como la técnica de referencia para la identificación taxonómica microbiana (Slabbinck et al. 2010).

Por otro lado la espectrometría de masas por desorción/ionización con láser asistido por matriz con tiempo de vuelo (MALDI-TOF) ha venido instaurándose en los laboratorios de microbiología clínica por ser una tecnología de identificación de microorganismos rápida, precisa y menos costosa que las técnicas convencionales  (Desai et al. 2012). Esta técnica se basa en el análisis espectral de proteínas. La identificación se realiza por comparación del espectro del microorganismo con espectros registrados en una base de datos de referencia  (Desai et al. 2012). 

En el Perú, la FQ es poco conocida, con deficiente tratamiento, falta de pruebas de diagnóstico de la enfermedad mediante tamizaje neonatal y de centros capaces de realizar la prueba del sudor lo que conducen a que la mayoría de niños con FQ no sean diagnosticados o diagnosticados muy tardíamente. En consecuencia, los pacientes peruanos tienen una esperanza de vida muy inferior comparada con los pacientes europeos y norte americanos (Samieniego S., com.Pers.).

El objetivo de este estudio fue identificar y caracterizar los patógenos bacterianos de las vías respiratorias detectados en el esputo de pacientes peruanos. La composición de la microbiota de un total de 21 muestras de esputo de pacientes peruanos fue investigada utilizando métodos basados en cultivo, y análisis por espectrometría de masas MALDI TOF y MALDI TOF TOF en niños con FQ.



MATERIAL Y MÉTODOS

Contactos con pacientes
En un primer tiempo, se realizó una sensibilización y comunicación a los padres de pacientes con FQ y doctores pediatras mediante las redes sociales y a través de reuniones en Lima en el Hospital Nacional E. Rebagliati (EsSalud) y el Instituto nacional de Salud del Niño bajo el ministerio de salud (MINSA) que siguen la totalidad de los pacientes peruanos con FQ. 
Declaración de ética para la participación en el estudio 
Se respectaron las normas médicas y éticas así como los derechos de los pacientes con FQ. Por ello los pacientes firmaron cartas de consentimiento de acuerdo con las normas de ética propias a cada hospital para llevar a cabo el proyecto.
Muestreo
El análisis fue dirigido a los pacientes con FQ diagnosticados mediante un cuadro clínico característico y un diagnóstico positivo a la prueba del sudor (> 60 mmol/l de cloruro). Las muestras consistieron en 2-4 ml de esputo fresco colectados en vasos estériles y conservados a 4°C hasta su procesamiento.  
Evaluación macroscópica y microscópica de la muestra de esputo
Una primera evaluación macroscópica se realizó para determinar si las muestras recolectadas eran efectivamente esputo o solo saliva. La evaluación microscópica consistió en una tinción Gram para evaluar la relación entre células epiteliales (CEs) y leucocitos polimorfonucleares (PMNs) y abundancia relativa de microorganismos.
Aislamiento y purificación bacteriana
Para el aislamiento de las bacterias patógenas, se sembró por extensión  aproximadamente 10 μL del esputo de cada paciente en Agar sangre, centrimide, MacConkey, y Burkholderia Cepacie Complex (BCC) y se incubó a 37ºC entre 24 y 72 h. Las siembras en agar sangre fueron incubadas en condiciones anaeróbicas. Una vez que se obtuvo crecimiento, se procedió a purificar las cepas seleccionando cada cepa que presentaba un fenotipo distinto.

Extracción  de ADN y reacción en cadena de la polimerasa
El ADN fue extraído a partir de cultivos puros usando el protocolo rápido de extracción siguiendo las recomendaciones del proveedor (Concepto Azul DNA extraction kit). El ADN se amplificó mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando primers universales 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) y 1492R (GGYTACCTTGTTAGGACTT) (Frank et al. 2008). Los productos de amplificación se analizaron por electroforesis. Las muestras positivas fueron enviadas a la compañía biotecnológica Macrogen-USA, para ser secuenciadas.
Análisis de Datos
Los resultados de las secuencias de nucleótidos del gen ARNr 16S se alinearon empleando el programa Mega 6 y se analizaron utilizando el BLAST de NCBI.
Espectrometría de masas MALDI TOF
Las cepas puras previamente obtenidas fueron cultivadas en medio Tryptic Soy Broth (TSB) durante 24 horas a  37°C, estas fueron lavadas con agua HPLC luego fueron espoteadas directamente a la placa MALDI. Luego se secaron a temperatura ambiente y se les adiciono a cada muestra 1 µl de matriz Acido sinapínico (10mg/ml disuelta en 70% de acetonitrilo y 30% de agua grado HPLC con 0.1% de TFA (V/V), Después se insertó en el espectrómetro de masas MALDI. Las muestras fueron analizadas en un rango de masas de 2000 – 20000 Da. La lectura se hizo en un modo operacional linear positivo. 

Espectrometría de masas MALDI TOF/TOF 
Extracción de proteínas bacterianas 
Se realizó una extracción de las proteínas totales de las células bacterianas usando el kit “Qproteome® Bacterial Protein” según las instrucciones del proveedor. 

Preparación del gel SDS-PAGE 1D
Se preparó un gel de separación al 12% según el protocolo establecido por Laemmli (1970).  El tratamiento de las proteínas consistió en calentar 25 µl de muestra y 10 µl de buffer de carga (2X loading protein loading buffer) durante 5 min a 95°C, y luego se dejó enfriar el mix por unos minutos. Luego, se migraron por 2 horas a 90 voltios en el gel de SDS-PAGE 1D. Para el revelado del gel se usaron las recomendaciones de Lomonnte (2007).  Después las bandas fueron procesadas siguiendo el  protocolo de Shevchenko et al. (2007).  Posteriormente se realizó la lectura de las muestras usando el equipo MALDI AB SCIEX TOF/TOF TM 5800. Estas, fueron analizadas en un modo reflector MS positivo, interpretadas con modo MS MS 1Kv positivo y los datos analizados con el software protein pilot 4.0. Las secuencias de aminoácidos fueron identificadas usando el programa de protein blast de NCBI disponible en; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins.

RESULTADOS
En este estudio se lograron aislar 127 cepas, de 21 pacientes peruanos con FQ. El análisis de secuencias del gen 16S ARNr permitió identificar bacterias a diferentes niveles taxonómicos lo que incluyó 11  familias, 25 especies y 10 identificaciones a nivel de género (Cuadro 1). La familia Pseudomonadaceae presentó el mayor número de cepas (56), seguido por Enterobacteriaceae (21), Staphylococcaceae (21) y Bacillaceae (8). En términos de diversidad, la familia Enterobacteriacae presentó 11 especies, seguida por Bacillaceae (6) y Streptococcaceae (4). A nivel de cepas las bacterias cultivables más aisladas fueron Pseudomonas aeruginosa, Stapylococcus aureus. Las cepas caracterizadas hasta el nivel de especie o genero debían presentar un nivel de similitud ≥99%, y entre 97% y 98% respectivamente en relación con la base de datos mundial NCBI.
Los perfiles de masa obtenidos para cada bacteria fueron registrados en la base de datos interno del equipo e identificadas según la secuencia obtenida del 16SARNr. (Figura 1). Esta figura ilustra el perfil peptídico de 4 cepas patógenas cuyas “huellas peptidicas” son específicas. Estos espectros podrán ser reutilizados como “base de datos propia”, donde la identificación es realizada mediante el perfil de los picos. 
También se realizaron los análisis por espectrometría de masas MALDI TOF TOF y se obtuvieron diversidad de proteínas de las bacterias más representativas encontradas en este estudio (Cuadro 2).




Microorganismos Familia N° de aislamientos Frecuencia de aislamientos (%) N° de pacientes Frecuencia de pacientes (%)
Pseudomonas aeruginosa Pseudomonadaceae 40 31.5 13 61.9
Staphylococcus aureus Staphylococcaceae 16 12.6 7 33.3
Pseudomonas sp. Pseudomonadaceae 15 11.8 10 47.6
Klebsiella oxytoca Enterobacteriaceae 4 3.1 2 9.5
Staphylococcus epidermidis Staphylococcaceae 3 2.4 2 9.5
Enterobacter hormaechei Enterobacteriaceae 3 2.4 3 14.3
Enterobacter cloacae Enterobacteriaceae 3 2.4 2 9.5
Enterococcus faecalis Enterococcaceae 3 2.4 3 14.3
Staphylococcus sp. Staphylococcaceae 2 1.6 2 9.5
serratia marcescens Enterobacteriaceae 2 1.6 2 9.5
Klebsiella pneumoniae Enterobacteriaceae 2 1.6 1 4.8
Klebsiella variicola Enterobacteriaceae 2 1.6 2 9.5
Enterobacter sp. Enterobacteriaceae 2 1.6 2 9.5
Neisseria flavescens Neisseriaceae 2 1.6 2 9.5
Bacillus thuringiensis Bacillaceae 2 1.6 2 9.5
Bacillus cereus Bacillaceae 2 1.6 2 9.5
Achromobacter sp. Alcaligenaceae 2 1.6 2 9.5
Streptococcus mitis Streptococcaceae 2 1.6 2 9.5
Streptococcus pyogenes Streptococcaceae 2 1.6 1 4.8
Stenotrophomonas sp. Xanthomonadaceae 2 1.6 2 9.5
Streptococcus sp. Streptococcaceae 2 1.6 2 9.5
Bacillus subtilis Bacillaceae 1 0.8 1 4.8
Achromobacter xylosoxidans Alcaligenaceae 1 0.8 1 4.8
Achromobacter denitrificans Alcaligenaceae 1 0.8 1 4.8
Klebsiella sp. Enterobacteriaceae 1 0.8 1 4.8
Leclercia adecarboxylata Enterobacteriaceae 1 0.8 1 4.8
Serratia sp. Enterobacteriaceae 1 0.8 1 4.8
Bacillus vallismortis Bacillaceae 1 0.8 1 4.8
Bacillus sp. Bacillaceae 1 0.8 1 4.8
Bacillus pumilus Bacillaceae 1 0.8 1 4.8
Pseudomonas luteola Pseudomonadaceae 1 0.8 1 4.8
Stenotrophomonas maltophilia Xanthomonadaceae 1 0.8 1 4.8
Streptococcus salivarius Streptococcaceae 1 0.8 1 4.8
Acinetobacter haemolyticus Moraxellaceae 1 0.8 1 4.8
Paenibacillus sp. Paenibacillaceae 1 0.8 1 4.8
25 especies, 10 géneros 11 familias 127 cepas 100% 21 pacientes

Cuadro 2. Secuencia de aminoácidos identificadas por MALDI TOF TOF a partir de bacterias aisladas de paciente con FQ del Perú
Familia Nombre de bacteria Secuencia de aminoácidos
Pseudomonas aeruginosa MVVTLIAPIAMEDGLR elongation factor Tu

PLLIVAEDVEGEALATLVVNNMR 60 kDa heat shock protein

ENTTIIDGAGVQADIEAR molecular chaperone GroEL

LVETLDSYIPEPVR elongation factor Tu 

DVLVNEYGVEGGR Porina
Porina extramenbrana
VNAVGYGESRPVADNATAEGR Outer membrane porin F
Pseudomonas sp. AAVEEGVVPGGGVALVR Chaperona molecular GroEl
AVVGKMIDAARAREAAR DNA gyrase subunit B 

ELSKPCADFR molecular chaperone GroEL 

Staphylococcus aureus VAAWYDNEMSYTAQLVR glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 

FGEEQVHIWR phosphoglycerate mutase 1 family protein

GNPTVEVEVLTESGAFGR enolase

staphylococcus epidermidis MFDGIEFR Ornithine carbamolytransfersa
EKMPIEVIYGFAQLKR class II fumarate hydratase 

Staphylococcus sp CDMVDDEELLELVEMEVR Translation elongation factor Tu
Factor de elongacion Tu
YDANNIYLATQYTQTYNATR OmpK36 porin
INLLDDNSFTR Outer membrane protein C
ADSSNSIAGDNHDTGVSPVFAGGVEWAVTR Outer membrane protein A 
WDEVGVDVVAEATGIFLTDETAR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
IEEALGEQAPFNGR Enolase
Klebsiella sp YAEIADHLGLSAPGDR Bifunctional acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase
Enterobacter hormaechei FDEFGSFDYGR Porin

LGYPVTDDLDVYTR Outer membrane protein A
YDANNIYLAAIYGEMR Outer membrane protein F
QMALGLVEPLPRGSIAER TetR family transcriptional regulator 
GELPSPLDPPGGCAFHPR Glutathione import ATP-binding protein GsiA 
VIDAEAPAVGRNGEPALLGV chemotaxis protein
Acrhomobacter xyloxidans KPKALYRAMR Adenylate cyclase
NHANVADWTWNNAGGR Cytochrome d ubiquinol oxidase subunit I
Bacillus thuringiensis GNPTVEVEVYTESGAFGR Enolase
AMLEDIAILTGGEVITEELGR Molecular chaperone GroEL
Bacillus pumilus VISWYDNESGYSHR Type I glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase







DISCUSIÓN
La secuenciación del gen 16S ARNr es la técnica estándar para la taxonomía bacteriana. Esta técnica es muy útil por el carácter universal del gen 16S ARNr, (Janda y Abbott., 2007). La bacteria con mayor predominancia en este estudio fue P. aeruginosa (31.5%). P. aeruginosa, se encontró en 13 de 21 (61.9%) de los pacientes analizados, lo que no es sorprendente por ser uno de los patógenos oportunistas más representativos reportados para esta enfermedad con una prevalencia a nivel mundial de aproximadamente el 80% de los pacientes con FQ (Hampton et al. 2014). 
Otro de los patógenos más representativos de los pacientes peruanos fue Staphylococcus aureus (12.6% de los aislados) también reportado como uno de los patógenos más virulentos y predominante en pacientes con FQ (Johnson et al. 2016). Dentro del cluster S. aureus, existen varios fenotipos como los MRSA (Methicillin-resistant S. aureus)  que representan una amenaza para los pacientes infectados (Seifert et al. 1999). La diferenciación entre los MRSA y las cepas comunes puede ser revelada con el cultivo en medios específicos. 

Bacterias del género Achromobacter, tales como; A. xylosoxidans (0.8%), A. denitrificans (0.8%), (Cuadro 1) fueron también aisladas. Las especies pertenecientes a este género  son microorganismos ambientales cultivados a partir de una gama de hábitats naturales  (Amoureux et al. 2013). 

El patógeno S. maltophilia es altamente resistente a la mayoría de los antibióticos, con la excepción de sulfametoxazol-trimetoprima (SXT). Se ha reportado la existencia de S. maltophilia resistentes a SXT sin poder elucidar el mecanismo de resistencia (Anderson et al. 2007). En este estudio también encontramos S. maltophilia  que fue  aislado de la muestra de esputo de un paciente con FQ. 

Dentro de las principales especies patógenas se observa la ausencia de Streptococcus pneumoniae, Burkholderia cepacia complex y Haemophilus influenzae que no fueron detectados. H. influenzae es considerado problemático a fuertes concentraciones. Su detección puede ser favorecida mediante el uso de medios de cultivos particulares que no fueron aplicados en este estudio. Sin embargo el método usado podría haberlo detectado (Denton et al. 2010). S. pneumoniae y BCC son patógenos muy agresivos que no fueron detectados, probablemente porque tienen una baja prevalencia a nivel mundial 
En conjunto nuestros resultados concuerdan parcialmente con trabajos anteriores realizados en Perú; Torres (2002) que determinó que P. aeruginosa estaba presente en el 81% de las muestras de esputo analizadas, seguidos por S. aureus, y S. pneumoniae y Castilla (2008) que identificó  que P. aeruginosa y S. aureus eran los primeros patógenos colonizadores en 35% y 25% de los casos respectivamente. También analizó que P. aeruginosa estaba presente en el 72% de los casos de fallecimientos. Sin embargo, estos autores evaluaron un número de muestras muy limitadas y evaluando únicamente mediante identificación fenotípica de los cultivo. 
Una particularidad interesante en los aislamientos realizados en pacientes con FQ en Perú y que no ha sido reportada es la presencia de varias cepas de Bacillus y Klebsiellas. Estos géneros no son muy comunes en FQ. Es interesante reportar que estas cepas fueron aisladas de pacientes más jóvenes que presentaban una mayor diversidad de gérmenes en sus pulmones (Beck et al. 2012). 
Varios pacientes contaban con contaminaciones cruzadas de tipo P. aeruginosa/Pseudomonas sp. (5) o P. aeruginosa/Staphylococcus sp./S. aureus (3) P. aeruginosa/S. maltophilia (1) (datos no presentados). La presencia de múltiples patógenos en un mismo paciente ha sido evidenciada frecuentemente porque estos patógenos son bacterias oportunistas ubiquitarias presentes en abundancia en suelos, aguas, que son comensales de la piel o de la boca, o en animales domésticos. Estas cepas “silvestres” se adaptan a las condiciones de los pulmones y terminan adquiriendo progresivamente resistencia a los antibióticos (Ramsay et al. 2016; Beck et al. 2012). 
En este estudio también utilizamos la tecnología de MALDI-TOF MS con el fin de obtener espectros de masas representativos de los patógenos de los pacientes, que previamente habían sido caracterizados mediante la secuenciación del gen ARNr 16S. Las correlaciones entre identificación de las cepas por secuenciación del gen ARNr 16S y espectros de masas fueron positivas. Esto no es sorprendente ya que la identificación bacteriana por comparación de espectros es confiable y repetible (Veloo et al. 2011). Se obtuvo espectros de todas las especies, sin embargo, se presentan de las más comunes  (Figura 1). El uso del sistema de MALDI-TOF MS en los procesos de identificación de bacterias reducirá el tiempo de análisis, y proporcionará información de valor para el tratamiento antimicrobiano. 
La identificación de péptidos obtenidos por MALDI TOF TOF, mostró que algunos de los fragmentos de proteínas obtenidas están relacionados con la virulencia o exacerbaciones producidas por bacterias  patógenas asociadas a FQ. 
De todas las proteínas identificadas en P. aeruginosa (Cuadro 2) la proteína GroEL fue una de las más frecuentes, esta pertenece a la familia de proteínas de choque térmico bacteriano. Estudios explican que una fuerte respuesta de anticuerpos a GroEL se ha encontrado en pacientes con FQ  con infecciones pulmonares crónicas causada por P. aeruginosa (Ulanova 1997). Otra proteína encontrada fue porina F (OprF) que corresponde a un canal de intercambio situado en la parte externa de la membrana. En Pseudomonas sp. se identificó la proteína DNA gyrase subunit B que es reconocida como un blanco terapéutico para el descubrimiento de fármacos antibacterianos (Li et al. 2015). 
En S. aureus  se identificó la  Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) que tiene una actividad glucolítica, y es responsable del sostenimiento del  patógeno dentro del huésped (Mukherjee et al. 2010). La proteina Enolasa  se encuentra en la superficie de S. aureus y participa en los procesos infecciosos (Wu et al. 2015).
Klebsiella pneumoniae, mostró  la proteína EF-Tu que corresponde a un factor de patogenicidad de la leucopenia causada por K. pneumoniae (Liu et al. 2014), mientras que las proteínas OmpK36 porin se relacionan con la resistencia al antibiótico carbapenen (Doménech-Sanchez et al. 2003).
La familia de reguladores TetR fue identificada en Achromobacer sp. Los TetR están involucrados en el control transcripcional de multitud de sistemas, incluyendo resistencia a fármacos, producción de antibióticos, patogenicidad, quórum sensing, formación de biopelículas, citocinesis (Deng, et al., 2013). 
Estudios comparativos entre B. cereus, B. thuringiensis, y B. anthracis han mostrado que sus proteínas de la pared celular y del citosol son muy similares entre sí, (Gohar et al. 2005). Estos autores identificaron las proteínas citosólicas: enolasa, GroEl, entre otras. Nuestro estudio también encontró dichas proteínas. 

Es importante, destacar que algunas proteínas encontradas en este estudio, no han sido previamente relacionadas a la fisiopatología de la FQ. Son necesarios más estudios de proteómica para lograr comprender la relación que existe entre las proteínas de las bacterias y la enfermedad.
CONCLUSIONES
La caracterización temprana de los patógenos que colonizan las vías respiratorias inferiores es central para prevenir la degradación rápida de los pulmones de los pacientes con FQ. La obtención y comparación de las secuencias peptídicas de las principales cepas patógenas con bases de datos de proteínas concordaron con las identificaciones realizadas por 16S ARNr. Es la primera vez que se utiliza el MALDI TOF TOF como herramienta de identificación en diagnóstico de patógenos asociados a la FQ. Este trabajo es el primero a nivel nacional a haber aplicado estas nuevas herramientas de diagnóstico de patógenos, y también el primer estudio epidemiológico representativo de la microbiota cultivable presente en las vías aéreas de pacientes con FQ en el Perú.
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